Molekulares Altern, biochemische Altersschätzung

	Proteinalterung (Eiweißalterung) und Altersschätzung: Forschungsprojekte und Dienstleistungen
	Das Altern des Menschen findet auf verschiedenen Ebenen statt, u.a. auch im Bereich der aus Aminosäuren bestehenden Eiweiße – einer biochemischen Ebene, die für die strukturelle und funktionelle Integrität des Organismus von großer Bedeutung ist. In Abhängigkeit von der Struktur eines Eiweißes können bestimmte Aminosäuren „Sollbruchstellen“ des Moleküls darstellen; dazu gehören Asparagin(Asn) und Asparaginsäure(Asp). Hier können spontan (d.h. nicht-enzymatisch) Veränderungen in Form einer Deamidierung von Asn sowie einer Isomerisierung und Razemisierung von Asp auftreten. Diese Veränderungen können als allmähliche Umwandlung von L-Asparaginsäure in ihre D-Form detektiert werden. Bei sehr jungen Eiweißen kann nur L-Asparaginsäure nachgewiesen werden. Mit zunehmendem Lebensalter kommt es zu einer Akkumulation der D-Form in langlebigen Eiweißen zahlreicher Gewebe. Vereinfachend und plakativ könnte man sagen: Je älter der Mensch wird, desto mehr D-Aminosäuren enthalten seine Eiweiße. Die genannten Aminosäurenmodifikationen haben wesentliche Folgen für die strukturelle und funktionelle Integrität der betroffenen Eiweiße. Sie dürften eine wesentliche Rolle im Rahmen des „molekularen Alterns“ spielen und werden zunehmend in Zusammenhang mit „Alterserkrankungen“ gebracht. In bestimmtem Geweben und Eiweißen ist der Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Akkumulation veränderter Aminosäurenreste und dem Lebensalter so eng, dass er zur Altersschätzung unter forensischen Fragestellungen genutzt werden kann (Schätzung des Lebensalters unbekannter Leichen im Rahmen der Identifikation, Altersschätzung bei lebenden Erwachsenen). Diese Methode ist das derzeit präziseste Verfahren zur Altersschätzung im Erwachsenenalter. Da sie einen erheblichen analytischen Aufwand erfordert, ist sie weltweit nur in wenigen Laboren etabliert, in Deutschland nur im Labor der Rechtsmedizin Düsseldorf. Nach dem Tod können Eiweiße des Knochens und der Zahnhartgewebe ebenfalls eine Umwandlung von L-Aminosäuren in ihre D-Form aufweisen. Diese verläuft sehr langsam und gibt Auskunft über die Veränderungen von Biomolekülen über Tausende und Millionen von Jahren; sie wurde zur Datierung (prä-)historischer Funde eingesetzt („Aminosäurendatierung“). Sollten Sie an weiteren Informationen zu Forschungsprojekten oder Dienstleistungen aus diesen Bereichen interessiert sein, wählen Sie bitte unter

Altern auf molekularer Ebene
Lebensalterschätzung
Liegezeitabhängige Veränderungen von Biomolekülen

	Altern auf molekularer Ebene
	Altersabhängige Veränderung des proteasomalen Abbaus von Histonen mit veränderten Asparagin- bzw. Asparaginsäureresten – Einfluss der umweltinduzierten Deamidierung, Isomerisierung und Razemisierung In Abhängigkeit von der Struktur eines Proteins können Asparagin(Asn) – und Asparaginsäure(Asp)-Reste „Sollbruchstellen“ des Moleküls darstellen, hier können spontan (d.h. nicht-enzymatisch) Veränderungen in Form einer Deamidierung von Asn sowie einer Isomerisierung und Razemisierung von Asp auftreten. Diese Veränderungen treten während der „physiologischen“ Proteinalterung auf sowie offenbar verstärkt unter ungünstigen Umgebungsbedingungen wie bei oxidativem Stress oder Einwirkung von UV-Strahlung (1, 2). Die Molekülmodifikationen führen zu Änderungen der Ladungsverhältnisse und der Konformation der betroffenen Proteine und haben so wesentliche Folgen für deren strukturelle und funktionelle Integrität. Sie werden zunehmend in Zusammenhang mit Erscheinungen des „physiologischen“ und „pathologischen“ Alterns gebracht (Übersichten bei 3, 4). Eine rasche Akkumulation veränderter Asn- und Asp-Reste wurde insbesondere für intrazelluläre Proteine beschrieben (Übersicht bei 4). Davon betroffen sind auch Histone (5-7); die Geschwindigkeit der Bildung von iso-Asp in Histon H2B wurde auf 1% pro Tag geschätzt (7). Wegen der weiten Verbreitung der spontanen Deamidierung von Asn wurde diese Veränderung als „molecular clock“ für biologische Prozesse, u.a. für die Initiierung einer Proteolyse diskutiert (4). Andererseits zeigen „pathologische“, nicht abbaubare (aggregierte) Proteine wie das Amyloid b-Protein beim M. Alzheimer oder Prionenproteine hohe Konzentrationen an isomerisierten und razemisierten Asp-Resten (8, 9). Damit stellt sich die Frage, ob Modifikationen von Asn- und/oder Asp-Resten den Abbau betroffener Proteine induzieren oder aber inhibieren können. Vor diesem Hintergrund soll der Abbau von Proteinen mit deamidierten Asn- und/oder isomerisierten bzw. razemisierten Asp-Resten durch das Proteasom untersucht werden, und zwar zunächst am Beispiel von Histonen. Das proteasomale System ist eines der wichtigsten intrazellulären proteolytischen Systeme. Durch einen komplizierten und aufwendigen Mechanismus - der Ubiquitinierung - werden Substrate dem proteasomalen Abbau zugeführt (10, 11). Das Proteasom selbst ist wahrscheinlich ohne Ubiquitinierung in der Lage oxidierte Proteine zu erkennen und diese abzubauen (12, 13). Während eines oxidativen Stresses kommt es zu einer komplizierten Regulation des proteasomalen Systems, dabei kann dieser oxidative Stress sowohl endogen als auch umweltinduziert sein. Fortlaufender oxidativer Stress führt offensichtlich zu einer dauerhaften Schädigung des proteasomalen Systems, wie er während der zellulären Alterung stattfindet. Alle proteasomalen Komponenten kommen ebenfalls im Zellkern vor und scheinen hier eine exklusive Rolle im Proteinabbau zu spielen. Die Änderungen der proteolytischen Kapazität während der Alterung scheinen im Zellkern interessanterweise weniger ausgeprägt zu sein. Die Untersuchung des Abbaus endogener Histone ist von besonderem Interesse, da der Schutz und die Stabilität nukleärer DNA durch den Histonpool gewährleistet wird. Vor diesem Hintergrund sollen die bisher unbekannten Mechanismen der Erkennung deamidierter, isomerisierter und razemisierter Aminosäuren auf den proteasomalen Abbau geprüft, der Altersgang dieses Stoffwechselweges untersucht und seine Beeinflussung durch Umweltnoxen getestet werden. Dieses Projekt wird in Kooperation mit der Arbeitsgruppe ''Molekulare Alternsforschung'' im Institut für umweltmedizinische Forschung an der Heinrich-Heine-Universität bearbeitet.
	1. Fujii, N., Tajima, N., Fujimoto, N., Takata, T. and Shimo-Oka, T. (2002) The presence of D-b-aspartic acid-containing peptides in elastic fibres of sun-damaged skin: a potent marker for ultraviolet-induced skin aging. Biochem Biophys Res Comm 294, 1047-1051 2. Ingrosso, D., D’Angelo, S., di Carlo, E., Perna, A.F., Zappia, V. and Galletti, P. (2000) Increased methyl esterification of altered aspartyl residues in erythrocyte membrane proteins in response to oxidative stress. Eur J Biochem 267, 4397-4405 3. Ritz-Timme, S. and Collins, M.J. (2002) Racemization of aspartic acid in human proteins. Ageing Res Rev , 43-59 4. Robinson, N.E. and Robinson, A.B. (2004) Molecular Clocks. Deamidation of asparaginyl and glutaminyl residues in peptides and proteins. Althouse press, Cave Junction, USA 5. Lindner, H., Sarg, B., Hoertnagel, B. and Helliger, W. (1998) The microheterogeneity of the mammalian H10 histone. Evidence for an age-dependent deamidation. J Biol Chem 273, 13324-13330 6. Lindner, H., Sarg, B., Grunicke, H. and Helliger, W. (1999) Age-dependent deamidation of H10 histones in chromatin of mammalian tissues. J Cancer Res Clin Oncol 125, 182-186 7. Young, A.L., Wayne, G.C. Hester, A.D., Mamula, M.J. and Aswad, D.W. (2001) Structural integrity of histone H2B in vivo requires the activity of protein L-isoaspartate O-methyltransferase, a putative protein repair enzyme. J Biol Chem 276, 37161-37165 8. Orpiszewski, J., Schormann, N., Kluve-Beckerman, B., Liepnieks, J.J. and Benson, M.D. (2000) Protein aging hypothesis of Alzheimer disease. FASEB J , 1255-1263 9. Sandmeier, E., Hunziker, P., Kunz, B., Sack, R. and Christen, P. (1999) Spontaneous deamidation and isomerization of Asn108 in prion peptide 106-126 and in full-length prion protein. Biochem Biophys Res Comm 261, 578-583 10. Coux, O., Tanaka, K., and Goldberg, A. (1996) Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem 65, 801–807. 11. Hershko, A. and Ciechanover, A. (1998) The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-79. 12. Dean, R.T., Fu, S., Stocker, R. and Davies, M.J. (1997) Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem J 324, 1-18. 13. Grune, T., Merker, K., Sandig, G. and Davies, K.J.A. (2003) Selective degradation of oxidatively modified protein substrates by the proteasome. Biochem Biophys Res Comm 305, 709-718.

	Lebensaltersschätzung
	Im Verlauf des Lebens kommt es zu einer Akkumulation von D-Asparaginsäureresten in menschlichen Proteinen (zum biochemischen Hintergrund (vgl. Ritz-Timme und Collins, 2002). Wird das "Mutterprotein" früh angelegt und dann nicht mehr ausgetauscht, ist es also permanent, ist der Zusammenhang zwischen dem Razemisierungsgrad von Asparaginsäure (AAR) und dem Protein- bzw. Lebensalter außerordentlich eng. Die Bestimmung des AAR in geeigneten Proteinen und Geweben kann deshalb Basis zuverlässiger Verahren zur Altersbestimmung sein. Dentin bietet mit einem ausreichendem Gehalt an permanenten Proteinen sowie seinem vergleichsweise homogenen Aufbau Optimalbedingungen für solche Altersbestimmungen, auch bei Untersuchung von nicht weiter aufgereinigtem Gesamtgewebe sind hier sehr gute Ergebnisse erzielbar (Ritz-Timme et al. 2002). Voraussetzung hierfür ist allerdings eine Standardisierung der Dentinprobengewinnung. Die Altersschätzung aufgrund des AAR in Dentin stellt das derzeit genaueste Verfahren zur Lebensaltersbestimmung bei Erwachsenen dar. Auch Disci intervertebrales enthalten permanente Proteine mit intravitaler Razemisierung von Asparaginsäure. Bei Untersuchung von standardisiert aus dem Anulus fibrosus entnommenen Proben ergibt sich ein enger Zusammenhang zwischen Razemisierungsgrad und Gewebsalter; danach sind Altersbestimmungen auch an Bandscheiben möglich (Ritz & Schütz, 1993). Im Vergleich zu Dentin werden die dabei erzielbaren Ergebnisse bei Analyse von Gesamtgewebe aber immer deutlich weniger zuverlässig sein, da die anatomische und biochemische Gewebsstruktur von Disci intervertebrales weniger homogen und konstant ist und die Proteinkomposition auch standardisiert gewonnener Gesamtgewebsproben deshalb stärker variiert. In Sonderfällen (z.B. Leichenteile) kann die Untersuchung von Bandscheibengewebe nach dem beschriebenen Verfahren zur Methode der Wahl werden. An Knochen erhobene Daten (Ritz et al. 1994, 1996, Ohtani, 1998, Ohtani et al. 1998) schließlich zeigten, dass komplizierte anatomische und biochemische Verhältnisse in einem nicht bradytrophen Gewebe eine Altersbestimmung durch Analyse von Gesamtgewebe oder nicht weiter aufgereinigten Gewebsextrakten unmöglich machen können, obwohl eine intravitale AAR stattfindet: In zunächst nicht weiter aufgereinigten Knochen-Säureextrakten findet sich zwar mit steigendem Lebensalter eine Akkumulation von D-Asparaginsäure. Der Zusammenhang zwischen Razemisierungsgrad und Alter ist hier jedoch nicht eng genug, um als Basis eines Verfahrens zur Altersbestimmung dienen zu können. Erst die Aufreinung von knochenmatrixassoziiertem Osteocalcin, einem offenbar permanenten Knochenpeptid, schaffte die Grundlage zur Nutzung der in-vivo-Razemisierung von Asparaginsäure für Altersbestimmungen an Knochen: Der Zusammenhang zwischen dem Razemisierungsgrad von Asparaginsäure in aufgereinigtem Osteocalcin und dem Lebensalter erwies sich als außerordentlich eng und kann als Basis zuverlässiger Verfahren zur Altersbestimmung, insbesondere auch im Erwachsenenalter, dienen (LIT Ritz et al.1996). Das am Beispiel von Knochen erarbeitete Konzept der Untersuchung aufgereinigter permanenter Proteine wird (bei Identifizierung weiterer permanenter Proteine) zusätzliche Anwendungsbereiche der Methode eröffnen und verspricht eine Erhöhung der Zuverlässigkeit entsprechender Verfahren. Diese biochemischen Verfahren zur Altersbestimmung finden ihre Indikationsbereiche im Erwachsenenalter; hier sind sie konventionellen morphologischen Methoden deutlich überlegen. Für Altersbestimmungen aufgrund des Razemisierungsgrades von Asparaginsäure erforderliche Gewebsentnahmen am Leichnam werden durch Anordnung der Staatsanwaltschaft im Rahmen der gerichtlichen Leichenöffnung legitimiert. Die für Altersbestimmungen am Lebenden erforderliche Gewinnung von Dentinproben kommt bei jungen Straftätern oder im Asylverfahren schon aus Rechtsgründen kaum in Betracht, insbesondere weil mit einer wirksamen Einwilligung in Zahnextraktionen oder Dentinbiopsien nicht zu rechnen ist (Ritz und Kaatsch 1996). Anders ist die Situation bei Erwachsenen mit unklarem Alter im Rentenverfahren (Ritz-Timme et al. 2003): In der Regel wünschen die Betroffenen ausdrücklich eine Untersuchung. Eine Zahnextraktion aus "rein sozialrechtlicher Indikation" wäre allerdings auch bei Einwilligung problematisch. Unproblematisch dagegen ist die Analyse eines aus medizinischer Indikation ohnehin extrahierten Zahnes. Informationen (Merkblätter) zu Gutachten „Altersschätzung aufgrund des AAR“ finden Sie in hier.

	Liegezeitabhängige Veränderungen von Biomolekülen Ansätze zur Revision der Aminosäurendatierung
	Bei der Biosynthese menschlicher und tierischer Proteine werden ausschließlich L-Aminosäuren eingesetzt. Unter bestimmten Bedingungen kann eine spontane, nicht-enzymatische Umwandlung der L-Aminosäurenreste in ihre D-Form (AAR, zum biochemischen Hintergrund vgl. Ritz-Timme & Collins, 2002) nachgewiesen werden. Die am schnellsten modifizierte Aminosäure Asparaginsäure kann bereits intravital (d.h. bei 37°C über maximal ca. 100 Jahre) eine messbare Razemisierung zeigen; andere Aminosäuren sind intravital nur wenig oder gar nicht betroffen. Nach dem Tod, unter völlig neuen physikochemischen Voraussetzungen und über lange Zeiträume, kommt es zur Modifikation zahlreicher Aminosäuren und damit zu einer allmählichen Akkumulation der D-Formen mit zunehmendem postmortalen Intervall. Diese Aminosäurenveränderungen können zur Beschreibung der Degradation alter Biomoleküle genutzt werden (Collins). Der Zusammenhang zwischen dem AAR und der Liegezeit ist Basis der „Aminosäurendatierung“, Diese ist allerdings nach einigen spektakulären Fehldatierungen (Bada et al. 1984, Collins et al. 1999) umstritten. Die bekannt gewordenen Fehldatierungen sind darauf zurückzuführen, dass die außerordentlich komplexe Natur der AAR während der Liegezeit unterschätzt wurde. Die zugrunde liegenden Prozesse werden wesentlich von der physikochemischen Umgebung der Aminosäurenreste beeinflußt. Die Kinetik der AAR wird deshalb entscheidend von den Umgebungsbedingungen (hier insbesondere von der Temperatur) sowie von Art und Ausmaß der Proteindegradation bestimmt. Während die Temperatur und ihr Einfluss auf die Aminosäurendatierung durch einschlägige mathematische Modelle für definierte „Mutterproteine“ erfasst werden können (“Thermal age approach“ der Arbeitsgruppe Collins), ist der Einfluss der Proteindegradation kaum vorhersagbar. Bei Untersuchung von Gesamtknochenprotein oder nicht definierten, groben Knochenextrakten (z.B. Säure- oder EDTA-Extrakten) archäologischer Proben ist die Proteinkomposition letztlich unbekannt, weil sie Resultat der Summe aller Degradationsprozesse ist. Wird das Verhältnis D-/L-Form einer Aminosäure in solchen Proben bestimmt, ist das Ergebnis von der Proteinzusammensetzung und damit vom Ausmaß der Degradationsprozesse abhängig, die in nur lockerer und indirekter Beziehung zur Liegezeit stehen. Eine genaue Datierung durch Untersuchung nicht definierter Proteinfraktionen ist also nicht möglich; dies lässt sich eben durch die bekannt gewordenen Fehldatierungen eindrucksvoll belegen. Der Einfluss von Degradationsprozessen kann nur ausgeschlossen werden, wenn definierte Proteine oder definierte Proteinfraktionen untersucht werden: Der Untersucher muss wissen, was genau er analysiert. Nur durch Bestimmung des Verhältnisses D-/L-Form geeigneter Aminosäuren in definierten Proben (optimalerweise in aufgereinigten Proteinen bzw. Peptiden) können Aminosäurendatierungen zu verwertbaren Ergebnissen führen. Die Aufreinigung definierter (kollagener oder nicht-kollagener) Proteinfraktionen aus Knochenfunden dürfte die Entwicklung einer neuen, vielversprechenden Datierungsmethode durch Revision der Aminosäurendatierung ermöglichen. Die Überprüfung dieser Hypothese ist Ziel eines Projektes in Kooperation mit der Arbeitsgruppe „Bioarch“ um Dr. M. Collins, Dept. Of Biology, University of York, GB.