Praktika

1. Praktikum "Molekulare Mechanismen der Tumorgenese"

Teil 1: NF-kB-Aktivierung in T-Zellen (AG Ludwig)

Der Transkriptionsfaktor NF-kB spielt eine wichtige Funktion bei der Pathogenabwehr und bei Entzündungsreaktionen, sowie bei der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Auch in der Tumorgenese spielt NF-kB eine wichtige Rolle, vor allem bei lymphatischen Tumoren. Ein wichtiger Schritt in der NF-kB-Aktivierung ist die Phosphorylierung des Inhibitors von NF-kB (IkBalpha), welches darauf hindegradiert wird und die transkriptionell aktiven NF-kB-Faktoren, wie p65 in den Zellkern entläßt. Für diese Phosphorylierung ist eine IkB-Kinase verantwortlich, welche aus drei Untereinheiten besteht und die in einem großen Proteinkomplex vorliegt.
Im 1. Teil des Praktikums soll die Aktivierung des NF-kB-Signalweges auf verschiedenen Ebenen der Signalkaskade nachgewiesen werden.

Folgende Experimente werden hierfür durchgeführt:

  • Zellzahlbestimmung, Zelltransfektion, Zellstimulation und Zelllyse
  • Nachweis der IKK-Aktivität im Immunkomplexkinaseassay
  • Nachweis der Phosphorylierung von IkB und des NF-kB-Faktors p65 durch phosphospezifische Antikörper im Western Blot
  • Nachweis der Degradation von IkBalpha (Western Blot)
  • Nachweis der transkriptionellen Aktivität von NF-kB im Reportergenassay
  • Nachweis der Kernwanderung von p65 mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie

2. Praktikum: " Molekulare Mechanismen der Tumorgenese"

Teil 2: Apoptose (AG Schulze-Osthoff)

Apoptose ist eine morphologisch definierte Form des programmierten Zelltodes und spielt eine fundamentale Rolle im Organismus. Sie ist verantwortlich für die Homöostase von Geweben und die Beseitigung von alten, verletzten, mutierten oder gefährlichen Zellen. Im Immunsystem ist sie der Hauptmechanismus, über den potentiell autoreaktive oder nutzlose Immunzellen beseitigt werden. Störungen der Apoptose können zudem an der Entwicklung von weiteren Krankheiten beteiligt sein. Eine vermehrte Apoptose trägt zur Depletion von CD4+-T-Zellen bei AIDS bei. Im Gegensatz dazu ist Apoptose bei Krebs in transformierten Zellen oft vermindert. So sind verschiedene Mechanismen beschrieben worden, wie sich Krebszellen vor Apoptoseinduktion durch das Immunsystem schützen. Apoptose kann über Todesrezeptoren (z.B. TNF-R1, CD95) und über das Mitochondrium ausgelöst werden. Wichtige Mediatoren und Regulatoren der Apoptose sind Caspasen (Cysteinyl-Proteasen) und Mitglieder der Bcl-2 Familie. Hier unterscheidet man anti- (z.B. Bcl-2, Bcl-x1) und pro-apoptotische Familienmitglieder (z.B. Bax, Bak, Bid).

Im 2. Teil des Praktikums sollen molekulare und morphologische Veränderungen während der Apoptose nachgewiesen werden.
Folgende Experimente werden hierfür durchgeführt:

  • Zellzahlbestimmung, Zellstimulation und Zell-Lyse
  • Lichtmikroskopische Analyse der Apoptose
  • Nachweis der CD95-Expression durch FACS-Analyse
  • Nachweis der DNA-Degradation während der Apoptose (FACS)
  • Co-Immunprozipitation des CD95 death-inducing signaling complex (DISC) und Analyse per Western Blot
  • Nachweis der Translokation von GFP-Bax mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie

3. Praktikum im Urologischen Forschungslabor

zum Modul "Molekulare Biologie menschlicher Tumoren" (vorläufiges Programm)

Inhalt:

  • Analyse von genetischen und epigenetischen Veränderungen in urologischen Tumorzellen:
  • Nachweis von Gendeletionen
  • Nachweis von LOH
  • Nachweis veränderter Expression (RNA und Protein)
  • Nachweis veränderter DNA-Methylierung
  • Nachweis von akkumuliertem (mutiertem) p53

Techniken:

  • DNA-Präparation aus Zellkulturen
  • Bestimmung der DNA-Konzentration
  • CDKN2A-DNA-PCR
  • RNA-Isolation
  • RT-PCR, RT-Reaktion, CDKN2A-cDNA-PCR, GAPDH-cDNA-PCR, Agarosegelelektrophorese
  • Bisulfitumwandlung von genomischer DNA
  • MS-(Methylierungs-spezifische)-PCR)
  • Untersuchungen von Gen-Amplifikationen und LOH
  • Proteinextraktion
  • Quantitative Proteinbestimmung
  • Gelelektrophorese
  • Proteintransfer (Westernblotting)
  • Immundetektion