Ausgewählte Publikationen des SFB974

Hier finden Sie eine Auswahl von Publikationen, die im Rahmen des SFB 974 entstanden sind. Vollständige Publikationslisten befinden sich auf den Seiten der jeweiligen Teilprojekte.


Strukturelle Anordnungen des di- und oligomeren G-Protein-gekoppelten Rezeptors TGR5 in lebenden Zellen: eine kombinierte Studie von MFIS-FRET und integrativer Modellierung

FRET hervorgerufen durch TGR5-Multimere (oben)

TGR5 ist der erste entdeckte gallensalzaktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptor (GPCR), der als potentielles therapeutisches Ziel für Stoffwechselstörungen gilt. Bisher sind Struktur- und Multimerisierungseigenschaften für TGR5 weitgehend unbekannt. Wir wendeten eine kombinierte Strategie der Zellbiologie, Multiparameter-Fluoreszenz-Image-Spektroskopie (MFIS) und integrativen Modellierung an, um strukturelle Informationen über Dimerisierung und Oligomerisierung höherer Ordnung von TGR5-Wildtyp- (wt) und Y111-Varianten zu erhalten. Wt-TGR5 und die Varianten wurden hierzu mit fluoreszierenden Proteinen fusioniert. Tyrosin 111 befindet sich in der Transmembran-Helix 3 als Teil des hochkonservierten ERY-Motivs. Co-Immunopräzipitation und MFIS-FRET-Messungen mit steigendem Akzeptor-Donor-Verhältnis zeigten, dass wt-TGR5 Oligomere höherer Ordnung bildet, ein Prozess, der in der TGR5-Y111A-Variante gehindert ist. Aus der Konzentrationsabhängigkeit der MFIS-FRET-Daten geht hervor, dass Oligomere höherer Ordnung - wahrscheinlich organisiert als Reihen von Tetrameren - aus Dimeren gebildet werden. Hierbei wird angenommen, dass die TGR5-Y111A-Variante die kleinste Einheit bildet. Oligomere höherer Ordnung haben wahrscheinlich eine lineare Anordnung mit Dimerisierungsepitopen, an denen die Transmembranhelix 1 und Helix 8 sowie die Transmembranhelix 5 beteiligt sind. Letztere Interaktion wird vermutlich durch die Y111A-Mutation gestört. Das vorgeschlagene Modell der TGR5-Oligomerisierung erweitert unsere Sicht auf mögliche Oligomerisierungsmuster und ‑affinitäten von Klasse-A GPCRs.

Abbildung: FRET hervorgerufen durch TGR5-Multimere (oben) und berechnete Aufenthaltswahrscheinlichkeit eines Fluorophores (unten).

Greife, A., Felekyan, S., Ma, Q., Gertzen, C.G.W., Spomer, L., Dimura, M., Peulen, T.O., Wöhler, C., Häussinger, D., Gohlke, H., Keitel, V., Seidel, C.A.M. Structural assemblies of the di- and oligomeric G-protein coupled receptor TGR5 in live cells: an MFIS-FRET and integrative modeling study. Sci. Rep. 2016, 6, 36792.



Leberspezifischer Glutaminsynthetase-Knockout induziert Hyperammonämie und oxidativen Stress im Maushirn

GS-expression in der Leber in Wildtyp (GSfl/fl) und KO-Maus (GSfl/fl-AlbCre)
GS-expression in der Leber in Wildtyp und KO-Maus (GSfl/fl-AlbCre)

Ammoniak spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der hepatischen Enzephalopathie. In der Leber wird Ammoniak überwiegend im Harnstoffzyklus metabolisiert. Residualer, nicht im Harnstoffzyklus entgifteter Ammoniak, wird von einer perivenösen Hepatozytensubpopulation, den sogenannten „Scavenger Zellen“, mit hoher Affinität aufgenommen und von der dort exklusiv exprimierten Glutaminsynthetase (GS) für die Glutaminsynthese genutzt. Die Bedeutung der in der Leber exprimierten GS für die systemische Ammoniakhomöostase wurde mit Hilfe einer leberspezifischen GS-Knockout Mauslinie untersucht. Es konnte experimentell belegt werden, dass in den Scavenger-Zellen der Leber exprimierte GS essentiell ist für die Aufrechterhaltung des systemischen Ammoniakspiegels. Die aus dem leberspezifischen Knockout der GS resultierende chronische Hyperammonämie war mit der Entstehung von zerebralem oxidativem Stress, mit der Beeinträchtigung von lokomotorischen Eigenschaften, sowie mit Verhaltensauffälligkeiten verbunden.

Qvartskhava N, Lang PA, Görg B, Pozdeev VI, Ortiz MP, Lang KS, Bidmon HJ, Lang E, Leibrock CB, Herebian D, Bode JG, Lang F, Häussinger D. (2015) Hyperammonemia in gene-targeted mice lacking functional hepatic glutamine synthetase. PNAS 112(17): 5521-6.


Hepatische Sternzellen und Leberregeneration

Abbildung
Sternzellen differenzieren zu Hepatozyten

Die Identität und Funktion von hepatischen Sternzellen in der normalen Leber war bislang unklar. Sternzellen wurden in der Vergangenheit ausschließlich mit fibrotischen Prozessen chronischer Erkrankungen der Leber in Zusammenhang gebracht. Im Rahmen des SFB974 wurden Sternzellen nun erstmals als mesenchymale Stammzellen (MSC) der Leber identifiziert [1], die ihre Eigenschaften zwischen Endothelzellen und Hepatozyten im Disseschen Raum der Leber erhalten. Der Dissesche Raum erfüllt für Sternzellen die Funktion einer Stammzellnische [2]. Auch bisher unbekannte Aufgaben der Sternzellen in der fötalen und adulten Leber wurden entdeckt. Sternzellen unterstützen hämatopoietische Stamm- und Progenitorzellen während der Blutbildung in der fötalen Leber [1] und sind an der Regeneration der Leber beteiligt, wie durch Transplantationsexperimente mit Sternzellen der Leber und des Pankreas gezeigt wurde [3, 4]. Transplantierte und isolierte Sternzellen besitzen die Fähigkeit Hepatozyten zu bilden. Diese hepatische Differenzierung kann in isolierten Sternzellen durch eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren HGF (hepatocyte growth factor) und FGF4 (fibroblast growth factor) eingeleitet werden [3, 4] (Abbildung 1). Im Zuge der Differenzierung werden Sternzellen sowie andere MSC aus dem Knochenmark und der Nabelschnur vorübergehend zu Leberprogenitorzellen [3]. Diese Befunde zeigen, dass die bereits seit langem bekannten Progenitorzellen von Hepatozyten aus Sternzellen entstehen können und Sternzellen somit eine wichtige Funktion bei der Regeneration der Leber erfüllen.

Abbildung 1: Isolierte Sternzellen der Leber differenzieren zu Hepatozyten
Sternzellen der Rattenleber wurden für 21 Tage mit den Wachstumsfaktoren HGF (hepatocyte growth factor) und FGF4 (fibroblast growth factor) behandelt. Neben dem mesodermalen Filamentprotein Desmin, welches Sternzellen kennzeichnet, können Hepatozyten mit Keratin 18 (rot) und Resten des Desmins (grün) durch eine Immunfluoreszenzfärbung detektiert werden. Das gleichzeitige Auftreten des Keratins 18 und Desmins zeigt, dass Hepatozyten aus Sternzellen der Leber entstehen können.

[1] Kordes C, Sawitza I, Götze S, Häussinger D (2013) "Hepatic stellate cells support hematopoiesis and are liver-resident mesenchymal stem cells." Cell Physiol Biochem. 31(2-3):290-304.

[2] Kordes C, Häussinger D (2013) "Hepatic stem cell niches." J Clin Invest. 123(5):1874-1880.

[3] Kordes C, Sawitza I, Götze S, Herebian D, Häussinger D (2014) "Hepatic stellate cells contribute to progenitor cells and liver regeneration." J Clin Invest. 124(12):5503-15.

[4] Kordes C, Sawitza I, Götze S, Häussinger D (2012) "Stellate cells from rat pancreas are stem cells and can contribute to liver regeneration." PLoS One. 7:e51878.


Eine neuartige Mutation innerhalb der Transmembranhelix der Gallensalz Exportpumpe (BSEP, ABC B11) mit verzögerter Entwicklung von Zirrhose

Coverpage von Liver International

Benigne wiederkehrende intrahepatische Cholestase wurde in einem Geschwisterpaar diagnostiziert. Sequenzierungen ergaben das im BSEP Gen eine Mutation (G3749S) vorlag. Diese Mutation lokalisiert in der vorhergesagten sechsten Transmembranhelix dieses ABC Transporters. Während die Plasmamembran Lokalisation nicht beeinflusst wurde, konnte in in vitro Experimenten nachgewiesen werden, dass eine drastisch reduzierte Transportfunktion vorlag. Im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen BSEP Mutationen in Transmembranregionen erzeugt die G374S Mutante einen Phänotyp, der zwischen BRIC-2 und PFIC-2 angesiedelt ist.

Stindt J, Ellinger P, Weissenberger K, Dröge C, Herebian D, Mayatepek E, Homey B, Braun S, Schulte am Esch J, Horacek M, Canbay A, Schmitt L, Häussinger D, Kubitz R (2013). "A novel mutation within a transmembrane helix of the bile salt export pump (BSEP, ABCB11) with delayed development of cirrhosis." Liver Int. 33(10):1527-35


α5ß1-Integrine sind Sensoren für Tauroursodesoxycholat in Hepatozyten

Zeitschriftencover

Die Gallensäure Ursodesoxycholsäure, die in vivo in das Taurinkonjugat Tauroursodesoxycholsäure (TUDC) konvertiert wird, wird als Standardtherapeutikum bei cholestatischen Lebererkrankungen eingesetzt. Obwohl bereits vor mehr als 1000 Jahren als Bestandteil der getrockneten Galle von Schwarzbären in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet, war bis dato kein molekularer Sensor in Leberzellen entdeckt worden, durch den TUDC seine choleretischen und anticholestatischen Wirkungen initiieren könnte. Durch Kombination von molekular- und zellbiologischen Untersuchungen, Leberperfundierungsstudien und Molekulardynamiksimulationen wurde in der vorliegenden Arbeit hauptsächlich zytosolisch vorkommendes a5b1-Integrin als dieser Sensor identifiziert. Dieses Ergebnis erklärt nicht nur die choleretischen und hepatoprotektiven Eigenschaften von TUDC sondern auch seine Leberspezifität. Zudem liefert diese Arbeit das erste Modell der TUDC/a5b1-Integrin-Interaktion auf atomarer Ebene, was für die Entwicklung potentieller neuer Wirkstoffe von Bedeutung ist.

Gohlke H, Schmitz B, Sommerfeld A, Reinehr R, Häussinger D (2013) "α5 β1-integrins are sensors for tauroursodeoxycholic acid in hepatocytes." Hepatology 57(3):1117-29


Tauroursodeoxycholat schützt Rattenhepatozyten vor gallensäureinduzierter Apoptose mittels β1-Integrin und Proteinkinase-A abhängiger Mechanismen

Anhand von Experimenten an der isoliert perfundierten Rattenleber und an isolierten primären Hepatozyten wurde untersucht, mittels welcher Mechanismen Tauroursodeoxycholat (TUDC) Hepatozyten vor Gallensäure-induzierter Apoptose schützt. Es wurde gezeigt, dass der anti-apoptotische Effekt von TUDC durch eine β1-Integrin-vermittelte Bildung von cAMP induziert wird. Der Knockdown von β1-Integrin Zellen hob den anti-apoptotischen Effekt von TUDC vollständig auf. Dabei kam es zur Hemmung der durch hydrophobe Gallensäuren-induzierten Aktivierung des CD95-Todesrezeptors durch gleichzeitige Hemmung der c-jun-NH2-Terminalkinase (JNK)-Aktivierung infolge einer MAP-Kinase-Phosphatase-1-Induktion (MKP-1) und einer Phosphorylierung des CD95 an Serin- und Threoninresten durch die Proteinkinase A. Die Untersuchungen zeigten, dass Integrine als unmittelbare TUDC-Sensoren fungieren und sowohl choleretische als auch zytoprotektive Wirkungen der Gallensäure vermitteln.

Sommerfeld A, Reinehr R, Häussinger D (2015) „Tauroursodeoxycholate Protects Rat Hepatocytes from Bile Acid-Induced Apoptosis via β1-Integrin- and Protein Kinase A-Dependent Mechanisms“ Cell Physiol Biochem. 36(3):866-883


Hyperosmotischer Stress aktiviert die Expression von Mitgliedern der miR-15/107 Familie und induziert die Herunterregulierung von anti-apoptotischen Genen in der Rattenleber

Schematische Darstellung des kurz- und langfristigen hyperosmotischen Signalling hin zur Apoptose
Schematische Darstellung des hyperosmotischen Signaling

In dieser Studie wurde perfundierte Rattenleber einem hyperosmotischen Milieu ausgesetzt. Dies induzierte eine rasche Hochregulierung von miR-15a, miR-15b und miR-16, Mitgliedern der miR-15/107 microRNA Superfamilie. Gleichzeitig wurde die Expression von bestimmten anti-apoptotischen Genen, die bekannte oder vermutete Targets dieser microRNAs sind, signifikant verringert. Durch die Gabe von NOX- und JNK-Inhibitoren sowie von Benzylamin konnte gezeigt werden, dass die beobachtet Reaktion durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt wurde. Daraus wird geschlussfolgert, dass die Antwort der drei microRNAs  auf osmotischen Stress ROS-vermittelt ist und zum Entstehen eines proapoptotischen Phänotyps beitragen könnte.

Santosa D, Castoldi M, Paluschinski M, Sommerfeld A, Häussinger D (2015) “Hyperosmotic stress activates the expression of members of the miR-15/107 family and induces downregulation of anti-apoptotic genes in rat liver“ Sci Rep. 5, 12292


Identifizierung von Zytokin-induzierter Modulation der microRNA-Expression und -Sekretion mittels eines neuartigen microRNA spezifischen qPCR Assays

Schematische Darstellung der miQPCR
Workflow der cDNA Synthese beim miQPCR Ansatz

MicroRNAs sind eine Klasse regulierender nicht-codierender RNAs, welche die Genexpression post-transkriptionell modulieren. MicroRNAs spielen in der Regulation zellulärer Prozesse eine entscheidende Rolle und ihr Profiling ist eine potentiell wichtige Quelle für Biomarker bei  der Diagnose und Prognose menschlicher Krankheiten. In dieser Publikation stellen wir miQPCR vor, eine neue, kostengünstige und gut adaptierbare Methode zur Quantifizierung von microRNA Expression mittels RealTime PCR. In unserer Studie analysierten wir zelluläre und frei zirkulierende microRNAs, die von primären Rattenhepatozyten nach Stimulation mit Zytokinen und Wachstumsfaktoren sekretiert wurden. Dies ermöglichte uns, zum ersten Mal sowohl eine weitverbreitete Modulation der Expression als auch der Sekretion von microRNA zu bestimmen. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die pleiotrope Aktivität humoraler Faktoren auf microRNAs die Leberfunktion in Folge von Schädigung und Regeneration stark beeinflusst.

Benes V, Collier P, Kordes C, Stolte J, Rausch T, Muckentaler MU, Häussinger D, Castoldi M (2015) „Identification of cytokine-induced modulation of microRNA expression and secretion as measured by a novel microRNA specific qPCR assay“ Sci Rep. 5: 11590


Eine membrannahe, C-terminale Alphahelix ist notwendig für die TGR5-Plasmamembranlokalisation und -Funktion

Einfluss der C-Terminus Struktur auf die TGR5 Lokalisierung
Einfluss der C-Terminus Struktur auf die TGR5 Lokalisierung

Der C-Terminus G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) ist wichtig für G-Protein-Kopplung und Aktivierung. Zusätzlich wurde bei einigen GPCRs ein Sortiersignal im C-Terminus gefunden, das einen korrekten Transport vom endoplasmatischen Retikulum in die Plasmamembran gewährleistet. Der C-Terminus des GPCR TGR5 weist allerdings kein bekanntes Sortiersignal auf, so dass andere Faktoren den Transport in die Plasmamembran gewährleisten müssen. In dieser Arbeit wurden daher Deletions- und Substitutionsvarianten des membrannahen C-Terminus von TGR5 bzgl. Plasmamembranlokalisierung und Funktion experimentell untersucht. Weiterhin wurden Peptide aus dieser Region mit Molekulardynamiksimulationen hinsichtlich ihrer Sekundärstruktur untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Plasmamembranlokalisierung und Antwortverhalten auf externe Liganden von TGR5 von der Anwesenheit eines langen (³ 9 Aminosäuren) a-helikalen Bereichs am C-Terminus abhängen, wohingegen die Gegenwart eines b-Stranges oder einer nur kurzen a-Helix dort zum Verbleib im endoplasmatischen Retikulum und zum Verlust der GPCR-Funktion führen. Diese Ergebnisse wurden mit TGR5-Chimären bestätigt. Wir schließen daraus, dass im Fall von TGR5 die Sekundärstruktur des membrannahen C-Terminus der bestimmende Faktor für Plasmamembrantransport und Antwortverhalten auf externe Liganden ist.

Spomer L, Gertzen CG, Schmitz B, Häussinger D, Gohlke H, Keitel V (2014) "A membrane-proximal, C-terminal α-helix is required for plasma membrane localization and function of the G Protein-coupled receptor (GPCR) TGR5." J Biol Chem. 289(6):3689-702


Detergenz Analyse und Reinigung der humanen ABC Transporter BSEP (ABC B11) und MDR3 (ABC B4) der Leber exprimiert in der Hefe Pichia pastoris

Nach erfolgreicher heterologer Expression der beiden humanen ABC Transporter Gene in der Hefe P. pastoris wurden 100 Detergenzien im Hinblick auf ihre Eigenschaft BSEP und MDR3 zu solubilisieren analysiert. Durch Fusion beider Membranproteine an GFP konnte die Solubilisierungseffizienz ohne Aufreinigung bestimmt und optimiert werden. Effiziente Detergenzien wurden in der Aufreinigung beider Transporter über tandem affinity purification verwendet und die Funktionalität beider ABC Transporter wurde nachgewiesen.

Ellinger P, Kluth M, Stindt J, Smits SH, Schmitt L. (2013) "Detergent screening and purification of the human liver ABC transporters BSEP (ABCB11) and MDR3 (ABCB4) expressed in the yeast Pichia pastoris." PLos One 8(4):e60620


Der epidermale EGF-Rezeptor kontrolliert den Schutz der Haut und verhindert Hautinfektionen

Zielgerichtete Medikamente sind fester Bestandteil der modernen Tumortherapie und sollen das Wachstum von Tumoren unterbinden. So blockiert eine große Gruppe dieser „Targeted cancer drugs“ den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR). Bei über 70 Prozent der behandelten Patienten treten jedoch als belastende Begleiterscheinungen Hautveränderungen auf wie entzündliche akneartige Ausschläge, Infektionen oder Hauttrockenheit.

Im Mausmodell sowie in Patientenproben konnte nachgewiesen werden, dass die Blockade des EGFR mittels zielgerichteter Tumormedikamente zentrale Prozesse im Hautorgan entscheidend stört. So beruhen die bei den Patienten beobachteten Hautentzündungen auf einer vermehrten Ausschüttung von Cytokinen und Chemokinen, die Entzündungszellen in die Haut locken. Auf der anderen Seite wird durch die EGFR-Blockade die Produktion körpereigener antimikrobieller Peptide oder Defensine gestört, so dass Hautinfektionen entstehen. Schließlich werden Barriere-Gene herunterreguliert, die den Feuchtigkeitsverlust der Haut steuern, was die fortschreitende Hauttrockenheit erklärt. Die Studie wurde unter anderem durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft sowie durch die Forschungskommission der Medizinischen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf gefördert.

Lichtenberger BM, Gerber PA, Holcmann M, Buhren BA, Amberg N, Smolle V, Schrumpf H, Boelke E, Ansari P, Mackenzie C, Wollenberg A, Kislat A, Fischer JW, Röck K, Harder J, Schröder JM, Homey B, Sibilia M (2013) Epidermal EGFR controls cutaneous host defense and prevents inflammation. Sci Transl Med. 5(199):199ra111


Funktionelle Wechselbeziehung zwischen Ras- und Rho-Signalwegen: p120RasGAP hemmt kompetitiv die katalytische RhoGAP-Aktivität von DLC (Deleted in Liver Cancer)*

Die drei deleted in liver cancer-Gene (DLC1-3) kodieren für Rho-spezifische GTPase-Aktivierendes Protein (RhoGAPs). Die Expression dieser Gene ist in verschiedenen Tumor häufig unterdrückt. Die RhoGAP-Aktivität, die für die DLC-abhängige Tumorsuppressor-Aktivität erforderlich ist, kann durch die SH3-domäne von einem Ras-spezifischen GAP (p120RasGAP) gehemmt werden. In dieser Arbeit haben wir die funktionelle Verbindung zwischen Ras- and Rho-Signalwegen mittels strukturbiologischen und biochemischen Methoden mechanistisch untersucht. Wir haben gezeigt, dass nur die SH3-Domäne von p120 die RhoGAP-Aktivität von allen drei DLC-Isoformen selektiv hemmt, d.h. eine Vielzahl vergleichbare SH3- oder RhoGAP-Proteine sind nicht in der Lage eine solche Interaktion mit RhoGAP einzugehen. Strukturelle und mutationelle Untersuchungen haben neue Einblicke in die atypische Interaktionsweise zwischen der p120 SH3-Domäne und der DLC1 RhoGAP-Domäne geliefert. Demzufolge assoziiert p120 mit der DLC1 RhoGAP-Domäne, indem es auf die katalytische Arginin-Finger der RhoGAP-Domäne abzielt und dessen Aktivität kompetitiv und wirksam hemmt. Die Ergebnisse in dieser Arbeit geben neuen Aufschluss über den Mechanismus, der den molekularen, DLC-inhibitorischen Effekten von p120 unterliegt und der eine funktionelle Wechselbeziehung zwischen den Ras- und Rho-Proteinen auf der Ebene der regulatorischen Proteinen aufzeigt.

Jaiswal M, Dvorsky R, Amin E, Risse SL, Fansa EK, Zhang SC, Taha MS, Gauhar AR, Nakhaei-Rad S, Kordes C, Koessmeier KT, Cirstea IC, Olayioye MA, Häussinger D, Ahmadian MR (2014) "Functional cross-talk between ras and rho pathways: a Ras-specific GTPase-activating protein (p120RasGAP) competitively inhibits the RhoGAP activity of deleted in liver cancer (DLC) tumor suppressor by masking the catalytic arginine finger." J Biol Chem 289:6839-49.


Messung des Wassergehalts des Gehirns mittels Magnetresonanztomographie

Funktionelle Bildgebungsmethoden (MR-PET-EEG) für die in vivo Untersuchung von Funktion und Energiestoffwechsel des Gehirns haben sich in den letzten Jahren wesentlich verbessert. Eine Veränderung des Gehirnstoffwechsels steht mit vielen Krankheitsstadien und Gehirnpathologien im Zusammenhang. Übergewicht, Diabetes und andere Stoffwechselerkrankungen sind aktuelle Beispiele, denn sie stellen einige der am weitesten verbreiteten Gesundheitsprobleme der modernen Gesellschaft dar. Dieses sind jedoch auf vielen Faktoren basierende Erkrankungen und erfordern deshalb einen multimodalen Ansatz zur Analyse der Pathophysiologie und zur Unterstützung bei der Entwicklung von erfolgversprechenden Strategien zur Vorbeugung und Heilung. Das Gehirn treibt den Stoffwechsel an und deshalb muss es im Mittelpunkt jeder umfangreichen diagnostischen Methode, die auf das Verständnis des Stoffwechsels zielt, stehen.

Mithilfe der quantitativen Bestimmung des Wassergehalts des Gewebes mittels Magnetresonanztomographie lässt sich die krankheitsbedingte Integrität des Hirngewebes überwachen. Die Methode ermöglicht eine Früherkennung von Erkrankungen wie z.B. kognitive Dysfunktion des Gehirns durch quantifizierte Bestimmung der Änderung des Wassergehalts.

Shah NJ (2014) Multimodal neuroimaging in humans at 9.4 T: a technological breakthrough towards an advanced metabolic imaging scanner. Brain Struct Funct. 220(4):1867-84

Abbas Z, Gras V, Möllenhoff K, Keil F, Oros-Peusquens AM, Shah NJ (2014) Analysis of proton-density bias corrections based on T1 measurement for robust quantification of water content in the brain at 3 Tesla. Magn Reson Med. 72(6):1735-45

Shah NJ, Ermer V, Oros-Peusquens AM (2011) Measuring the absolute water content of the brain using quantitative MRI. Methods Mold Biol. 711:29-64


Interaktion des Hepatitis C Virus- Proteins NS5A mit SH3 Domänen

Das Nichtstrukturprotein 5A (NS5A) des Hepatitis C Virus wurde von uns intensiv strukturell charakterisiert [1]. Wir konnten in Zusammenarbeit mit dem IBS Grenoble zeigen, dass NS5A(191-369) ein intrinsisch unstrukturiertes Protein ist, das drei Regionen aufweist, die transient α-helikale Strukturen annehmen. Diese werden teilweise von weitreichenden tertiären Interaktionen stabilisiert. NS5A(191-369) enthält eine Region mit drei klassischen Polyprolin-reichen (PxxP) Src homology 3 (SH3) Domäne-bindende Motive. Wir konnten zeigen, dass die SH3-Domäne des bridging integrator Proteins 1 (Bin1) hochaffin an die PxxP-Motive bindet. Interessanterweise bindet die Bin1-SH3-Domäne auch an zwei der drei transient α-helicalen Regionen, die keine kanonischen SH3-bindende Motive enthalten. Diese kanonischen und nicht-kanonischen Interaktionen haben wir weiter untersucht [2]. Dabei konnten wir zeigen, dass auch die SH3 Domänen von c-Src in vitro in der Lage ist mit NS5A über die kanonischen PxxP-Motive mit NS5A zu interagieren. Weiterhin haben wir kürzlich gezeigt, dass ein kurzes NS5A-Fragment, das die kanonischen PxxP-Motive enthält, in der Lage ist, einen natürlichen Liganden der Bin1-SH3-Domäne zu verdrängen [3].

[1] Feuerstein S, Solyom Z, Aladağ A, Favier A, Schwarten M, Hoffmann S, Willbold D,  Brutscher B (2012) Transient structure and SH3 interaction sites in an intrinsically disordered fragment of  the hepatitis C virus protein NS5A. J. Mol. Biol. 420, 310-32

[2] Schwarten M, Solyom Z, Feuerstein S, Aladağ A, Hoffmann S, Willbold D, Brutscher B (2013) Interaction of non-structural protein 5A of hepatitis C virus with SH3 domains using non-canonical binding sites. Biochemistry 52, 6160-6168

[3] Aladağ A, Hoffmann S, Stoldt M, Bösing C, Willbold D, Schwarten M (2014) Hepatitis C virus NS5A is able to competitively displace c-Myc from the Bin1 SH3 domain in vitro. J. Pept. Science 20, 334-340


Methoden zur Bestimmung der Struktur und Dynamik von intrinsisch unstrukturierten Proteinen mittels NMR-Spektroskopie

Im Teilprojekt A11 wird die strukturelle Grundlage der Interaktion von c-Src mit den Hepatitis C Virus Proteinen NS5A und NS5B untersucht. Bei NS5A handelt es sich um ein Protein, das neben einer strukturierten Domäne, zwei weitere Domänen enthält, die intrinsisch unstrukturiert sind. Das heißt diese Domänen haben keine definierte Tertiärstruktur. Dennoch bilden sie transient Sekundärstrukturelemente aus, die häufig wichtig für die Interaktion mit Liganden sind. Mittels NMR-Spektroskopie ist es möglich diese Proteine zu untersuchen, was aber auch verschiedene Herausforderungen birgt. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von B. Brutscher (IBS Grenoble)  konnten wir zwei Methoden entwickeln, die es erlauben die Struktur und Dynamik von intrinsisch unstrukturierten Proteinen mittels NMR-Spektroskopie zu bestimmen. In der ersten Publikation [1] beschreiben wir eine Methode, das iHADAMAC, die es erlaubt 2D 1H-15N-Spektren in sieben verschiedene 2D Spektren zu unterteilen, wobei jedes einer anderen Aminosäurereste-Klasse entspricht. Damit wird das sequenzspezifische Resonanzassignment von Proteinen mit einer geringen Signaldispersion, wie sie intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) aufweisen, wesentlich vereinfacht. Das konnten wir an einem 188 Aminosäurereste umfassenden Fragment von NS5A zeigen. Weiterhin haben wir die BEST-TROSY Experimente entwickelt [2]. Diese Auflösungs- und Sensititvitäts-optimierten Pulssequenzen bieten die Möglichkeit in kürzerer Zeit 3D Spektren von großen IDPs aufzunehmen. Die Leistungsfähigkeit dieser Experimente konnten wir wiederum an einen Fragment von NS5A, das dieses Mal 270  Aminosäurereste enthielt, zeigen. Mit der Entwicklung dieser Werkzeuge war es uns dann möglich NS5A weiter strukturell zu untersuchen.

[1] Feuerstein S, Plevin MJ, Willbold D, Brutscher B (2012) iHADAMAC: a complementary tool for sequential resonance assignment of globular and highly disordered protein. J. Magn. Res. 214, 329-334

[2] Solyom Z, Schwarten M, Geist L, Konrat R, Willbold D, Brutscher B (2013) BEST-TROSY experiments for time-efficient sequential resonance assignment of large disordered proteins. J. Biomol. NMR 55, 311-221


 
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  • Zuletzt aktualisiert am 29.11.2016
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