DFG-VIC-OPN-CD73

Projekt: "Modulation valvulärer interstitieller Zellen mittels zellbasierter und extrazellulärer matrixbasierter Mechanismen - Ansätze zur Vorbeugung der Herzklappenprothesendegeneration“

Projektleiter: Prof. Dr. med. Artur Lichtenberg, Prof. Dr. med. Payam Akhyari

Förderzeitraum: 01.01.2013 - 31.12.2016

Zusammenfassung:

In diesem Projekt soll die Rolle von extrazellulärem Matrixprotein Osteopontin und der Ekto-5’-Nukleotidase (CD73) bei der Entstehung der Herzklappendegeneration durch den Einsatz von dreidimensionalen Kulturen valvulärer Interstitialzellen (VIC) untersucht werden. Die dabei verwendeten Modelle unterscheiden sich durch die Komposition der extrazellulären Matrix (ECM).

Im ersten Abschnitt des Projektes wurde die Entwicklung von VIC in einer aus Matrigel und Kollagen Typ-1 hergestellten Matrix (mECM) untersucht. Überraschenderweise führte hier die aus 2D-Versuchen als potenter Induktor von Biomineralisation bekannte Behandlung mit prokalzifizierendem Medium zu keinem nennenswert pathologischen Remodelling. Auch bei biochemischer Untersuchung auf Protein und RNA-Ebene sind Unterschiede zwischen Basalbedingungen und prokalzifizierend stimulierten Bedingungen marginal. Daher wurde eine Modifikation des Kulturmodells zum zusätzlichen Aufbau einer passiven Spannung und damit zur Integration biomechanischer Stimulation eingeführt.

Ausgehend von diesem modifizierten Modell wurde im zweiten Projektabschnitt die Rolle von Osteopontin (OPN) bei der Biomineralisation von VIC untersucht. Hier wurde zunächst  anhand zahlreicher Experimente nachgewiesen, dass unter Verwendung von kommerziell erhältlichem, teilweise phosphryliertem Osteopontin sowohl in 2D als auch im modifizierten mECM Modell keine Auswirkung auf die Degeneration von VIC Kulturen zu beobachten ist. Hierbei wurden Endpunkte sowohl auf histologischer, als auch Genexpressionsebene oder auch proteinbiochemischer Ebene untersucht, um das Remodelling und die Biomineralisation der VIC zu erfassen. Eine biochemische Modifikation zur gesteigerten phosphorylierung oder auch Dephosphorylierung konnte schließlich unter stimulierten Bedingungen die Biomineralisation der VIC in 2D beeinflussen. Dieser Effekt ging jedoch unter den dreidimensionalen Bedingungen (mECM) verloren. Diese Ergebnisse wurden anschließend im Rahmen des dritten Projektabschnittes in einem neuartigen ex situ Modell zur Kultivierung von intaktem Aortenklappentaschengewebe validiert, wo OPN die in vitro Kalzifizierung von dreidimensionalen VIC Verbänden weder inhibieren noch beschleunigen konnte.

Im vierten Abschnitt des Projektes gezeigt werden, dass der purinerge Stoffwechsel eine bedeutende Rolle im Degenerationsprozess von Herzklappen spielt. Während eine Inhibition von CD39 zu einer erhöhten Verfügbarkeit von ATP und einem pro-degenerativen Effekt auf VICs führt, hatte eine Inhibition von CD73 einen protektiven Effekt unter pro-degenerativen Bedingungen. Dass dieser protektive Effekt mit einer Verminderung der Adenosinverfügbarkeit einhergeht, konnte schließlich durch die Verwendung verschiedener Adenosinrezeptor-Agonisten bestätigt werden. Die Verwendung von 3D-Modellen zur Untersuchung pro-degenerative Effekte bringt deutliche Vorteile, da in einer 2D-Umgebung bestimmte Mechanismen (z.B. Kollagensynthese) durch fehlende Matrix-Interkationen abweichen können. 

Im fünften Projektabschnitt erfolgte in Kooperation mit dem Laserzentrum Hannover die Etablierung eines dreidimensionalen Kulturmodells mit einer organotyischen ECM-Umgebung (dECM). Ausgehend von dezellularisierten Aortenklappen wurde unter Einsatz von Photodisruption der Matrixoberfläche durch einen Femtosekundenlaser erstmals eine in vitro Besiedelung des interstitiellen Raums von detergenzdezellularisierten Aortenklappentaschen erzielt. Es zeigte sich bei diesen Untersuchungen, dass unter in vitro Bedingungen eine intakte Basalmembran eine Barriere für die Einwanderung von VIC in das Innere der Klappenmatrix darstellt. Weitere Versuchsansätze zeigten schließlich, dass eine zusätzliche, enzymatische Manipulation der Basalmembran in Verbindung mit migrationsfördernden Kulturbedingungen eine Steigerung der Rebesiedelung erzielen können. Aber auch hier blieb die Zellverteilung innerhalb der 3D Kulturen suboptimal mit einer Konzentration der VIC nahe der Matrixoberfläche.

Im sechsten Projektabschnitt wurde ein gänzlich neuartiges Modell etabliert, das die Vorteile der organotypischen Matrix (dECM) mit der hervorragenden dreidimensioanlen Zellverteilung in mECM Modellen verbindet. Bei diesem Modell wurde aus dECM zunächst ein Hydrogel hergestellt, das anschließend unter Verwendung der o.g. Techniken mit VIC besiedelt zu einem neuartigen Modell (hECM) kombiniert werden kann. Für hECM erfolgte eine umfassende Charakterisierung auf biochemischer, ultrastruktureller sowie biomechanischer Ebene, um die Eignung dieses Modells für die Untersuchung degenerativer Vorgänge an VIC in einer natürlicheren Umgebung zu ermöglichen als dies mit herkömmlichen Verfahren möglich ist.

Veröffentlichungen:

  • Hof A, Raschke S, Baier K, Nehrenheim L, Selig JI, Schomaker M, Lichtenberg A, Meyer H, Akhyari P. Challenges in developing a reseeded, tissue-engineered aortic valve prosthesis. Eur J Cardiothorac Surg. 2016 Sep;50(3):446-55. doi: 10.1093/ejcts/ezw057. Epub 2016 Apr 15.
  • Weber A, Dakaras K, Barth M, Baier K, Schrader J, Lichtenberg A, Akhyari P. Elevated ATP Levels Promote the Mineralization of Valvular Interstitial Cells. Thorac cardiovasc Surg 2017; 65(S 01): S1-S110. DOI: 10.1055/s-0037-1598848. Kongressbeitrag
  • Raschke S, Lukic M, Nehrenheim L, Kistner J, Schlag F, Jenke A, Lichtenberg A, Akhyari P. Osteopontin Does not Inhibited Aortic Valve Fibrosis and Calcification in Three-Dimensional Ovine Aortic Valve Model. Thorac cardiovasc Surg 2017; 65(S 01): S1-S110. DOI: 10.1055/s-0037-1598849. Kongressbeitrag
  • Raschke S, Nehrenheim L, Barth M, Barbian A, Lichtenberg A, Akhyari P. Novel Three-Dimensional Hydrogel Model from Ovine Aortic Valve ECM to Study ECM Remodeling. Thorac cardiovasc Surg 2017; 65(S 01): S1-S110. DOI: 10.1055/s-0037-1598740. Kongressbeitrag
  • Raschke S, Nehrenheim L, Lichtenberg A, Akhyari P. Novel three-dimensional hydrogel model to study extracellular matrix remodelling of aortic valves related to the development of aortic stenosis. TERMIS-EU 2016. Kongressbeitrag
  • Weber A, Barth M, Selig JI, Raschke S, Dakaras K, Hof A, Hesse J, Schrader J, Lichtenberg A, Akhyari P. Enzymes of the purinergic signaling system exhibit diverse effects on the degeneration of valvular interstitial cells in a 3-D microenvironment.FASEB J. 2018 Mar 20:fj201701326R. doi: 10.1096/fj.201701326R.
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