Klinische Entwicklung

Prof. Dr. rer. nat. Gesine Kögler

Universitätsklinikum Düsseldorf / Gebäude 14.88
Moorenstrasse 5
40225 Düsseldorf

Klinische Entwicklung

Hämatopoietische Stammzellen aus „allogenem“ (gespendeten) Nabelschnurblut-Stand 3/2016

Die blutbildenden, sogenannten hämatopoietischen, Stammzellen des Nabelschnurblutes sind eine wichtige Spenderquelle für Patienten mit malignen oder genetischen Erkrankungen, die nur durch eine allogene (unverwandte) hämatopoietische Zelltransplantation geheilt werden können. Diese Patienten haben häufig keinen geeigneten 
HLA (human leukocyte antigen)– identischen verwandten oder unverwandten Knochenmarkfremdspender. Die Gewinnung und Spende (blutbildender) Stammzellen aus dem Nabelschnurblut wurde 1992 erstmals in Deutschland für allogenes verwandtes und unverwandtes Nabelschnurblut in der Jose Carreras Stammzellbank in Düsseldorf etabliert und seitdem für die Verwendung weltweit für Patienten zur Verfügung gestellt.

Die öffentlichen „nicht kommerziellen“ Stammzellbanken verwenden nur gespendetes Nabelschnurblut ab der 36. Schwangerschaftswoche mit der Freigabe und Einverständnis der Spende durch die Mutter.

Weltweit sind derzeit ca. 721.000 unverwandte Spenden in mehr als 160 nicht-kommerziellen Stammzellbanken gelagert und 41.472 Patienten mit über 70 Indikationen konnten transplantiert werden (WMDA, World Marrow Donor Association Stand 2014).

Indikationen:

  • maligne Erkrankungen des blutbildenden und lymphatischen Systems
  • Stoffwechselerkrankungen
  • Immundefekte
  • Tumore
  • Hämoglobinopathien und genetische Defekte

 

Die Anwendungsrate liegt damit bei ca. 6% der in öffentlichen Banken gelagerten Nabelschnurblutpräparate. Durch die Düsseldorfer Stammzellbank konnten bisher 1232 Nabelschnurblutpräparate (Stand 3/2016) für Patienten weltweit zur Verfügung gestellt werden.

 

Nabelschnurblut ist zusätzlich eine interessante Quelle für die Etablierung von Zelltherapeutika aus nicht-blutbildenden Stammzellen sowie „off the shelf“ Präparate für induziert pluripotente Stammzellen, sogenannte iPS , T-Zellen und Natürliche Killer-Zellen und selektionierte CD34+ zur Überbrückung/Beschleunigung der blutbildenden Rekonstitution nach Transplantation.

 

Biologische Vorteile des gespendeten Nabelschnurblutes auch für zukünftige regenerative Therapien

Nabelschnurblut enthält im Vergleich zu adulten Stammzellquellen wie Knochenmark eine hohe Konzentration an sich selbst erneuernden blutbilden Stamm- aber auch jungen Progenitor (Vorläufer)- Zellen. Hal Broxmeyer war 1986 der Erste, der hoch-proliferative blutbildende Zellen im Nabelschnurblut beschrieb. Bis heute ist nicht bekannt, warum diese Stammzellen bei Geburt in hoher Konzentration im Nabelschnurblut vorhanden sind, einen Tag nach der Geburt im Kind kaum noch nachgewiesen werden. Eine mögliche biologische Erklärung stellt die Umstellung der fetalen Hämatopoiese von der fetalen Leber zum Knochenmark bzw. die hypoxischen Sauerstoffbedingungen während der Fetalentwicklung dar. Ähnliche hypoxische Bedingungen führen zu vielfältigen, auf unterschiedlichen Entwicklungsstufen stehenden Nicht-blutbildenden Stammzellen im Nabelschnurblut wie mesenchymal-artige, stromale Elemente, die u.a. Knorpelzellen, relevant für die Knorpel/Knochenentstehung im Feten hervorbringen können.

 

Zusätzlich zu diesen einzigarten entwicklungsbiologischen Eigenschaften sind die Proliferationsfähigkeit, eine entsprechende längere Lebensdauer/Telomere und noch ungeschädigte DNA- und DNA-Reparaturmechanismen hervorzuheben. Aufgrund ihres neonatalen Charakters assoziiert mit genetischer Stabilität und geringem „Virusload“ stellen gespendete gelagerte Nabelschnurblutzellen zukünftig geeignete Kandidaten für die Generierung von induziert pluripotenten Stammzellen (iPS) dar. Inzwischen konnten u.a. Endothelzellen, CD34+ Zellen, sowie Stromazellen durch retrovirale bzw. andere Transduktionsmethoden wie episomaler Transduktion mit den Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-Myc bzw. mit 2 Faktoren von unterschiedlichen Arbeitsgruppen reprogrammiert werden.

 

Nachteile der iPS sind derzeit ähnlich wie bei embryonalen Stammzellen das Risiko der Tumorentstehung bzw. dass Zellkultur und gerichtete Differenzierung sehr lange Zeiträume bis zur kompletten Charakterisierung in Anspruch nehmen. Aus gesundheitsökonomischen Gesichtspunkten ist die Verwendung von Nabelschnurblut-abgeleiteten Stammzellen nur in der allogenen Verwendung für die Geweberegenerierung sinnvoll. Autologe (eigene) iPS-Zellen wären zwar eine Alternative, um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden, die Herstellung für den individuellen Patienten zu teuer und zu zeitintensiv.

 

Wesentliche Meilensteine des Einsatzes allogener gespendeter Nabelschnurblutpräparate

Die erste Nabelschnurbluttransplantation erfolgte Ende 1988 in Paris zwischen HLA-identischen Geschwistern bei der Indikation Fanconianämie. Der erste Fall der Behandlung einer Leukämie wurde 1992 berichtet.

 

Besonders ermutigend war die klinische Beobachtung, dass das Auftreten der akuten und chronischen GVHD (Spender gegen Empfänger-Reaktion) vergleichsweise gering war, sogar dann, wenn ein oder mehrere HLA-Allele nicht übereinstimmten.

Bei Kindern steht die Behandlung von angeborenen Immundefekten, genetische Erkrankungen und akute Leukämien im Vordergrund; bei adulten Patienten Leukämien, Lymphome und chronische Anämien. Nabelschnurblut wird alterativ zu Knochenmark oder peripheren mobilisierten Stammzellen eingesetzt, wenn kein passender Stammzellspender zu Verfügung steht. Dies ist regional Europa- und weltweit unterschiedlich. Die wichtigste Voraussetzung für die Transplantation ist die Mindestübereinstimmung der HLA-Gewebemerkmale.

 

Nabelschnurblut, welches bei-196°C gelagert wird, kann innerhalb kürzester Zeit (2 Tage) dem Transplantationszentrum zur Verfügung gestellt werden. Ein weiterer Vorteil der Nabelschnurbluttransplantation ist die immunologische Unreife des Immunsystems zum Zeitpunkt der Geburt. Fehlende Gedächtnis-T-Lymphozyten und T-Zellen des nicht-aktivierten, naiven Zelltyps sind Gründe, warum bei nicht-komplett HLA- identischer Übereinstimmung transplantiert werden kann und die GvHD dennoch wesentlich schwächer ist.

 

Aktuelle Daten zeigen, dass im Vergleich zwischen HLA-identischer Transplantation bei Erwachsenen (Geschwisterpaaren) zur unverwandten Knochenmark/Peripheren Stammzelltransplantation, die Lebensqualität nach Nabelschnurbluttransplantation deutlich besser ist. Dies ist auf eine viel schwächere oder gar nicht vorhandene chronische GVHD zurückzuführen. Aktuelle Daten von Hiwarkar et al klären den Mechanismus teilweise auf. Klinisch werden die Daten 2015 von Brunstein et al  bestätigt.

Ganz entscheidend für die Entwicklung der letzten Jahre war die Etablierung der Doppelnabelschnurbluttransplantation bei Erwachsenen, verringerte Rezidivrate bei Patienten mit Akuter Lymphatischer Leukämie und neue Technologien, die die Blutbildung ganz früh nach Transplantation durch vermehrte Zellzahlen (Expansion eines Nabelschnurblutes plus Infusion eines unmanipulierten Transplantates) verbessern.

Um gezielt erwachsenen Patienten zu helfen, war eine enge Kooperation und Logistik zwischen nicht-kommerziellen Stammzellbanken und Transplantationszentren im Weltverband notwendig.

 

Wesentliche Qualitätskriterien

Entscheidendes Qualitätskriterium eines Nabelschnurbluttransplantates ist neben dem HLA (Gewebe)-Typ, der Bestimmung des Anteils an hämatopoietischen Vorläuferzellen und der negativen Testung auf Infektionsmarker die Anzahl der Kernhaltigen Zellen, die in einem Präparat enthalten sind. Derzeit gilt, dass ein Patient mindestens 3.7x107 Kernhaltige Zellen /kg Körpergewicht erhalten muss, um die Mortalität nach Transplantation zu senken. Dies ist der Grund, dass die großen Stammzellbanken weltweit nur ca. 10% aller erhaltenen gespendeten Nabelschnurblutpräparate mit einer Mindestzellzahl von >1.3-1.6 x109kryokonservieren. Daten des  NMDP (www.marrow.org) und NetCord (www.netcord.org) haben gezeigt, dass nur zellreiche Präparate durch die Transplantationszentren angefordert werden.

Ein weiteres notwendiges Qualitätskriterium ist die NetCord/FACT Akkreditierung, die international eine Vergleichbarkeit und Standardisierung der Produkte gewährleistet. Diese weltweite Standardisierung ist seit 2004 eine wesentliche Grundlage für die Verbesserung der klinischen Daten.

Wie für die Jose Carreras Stammzellbank Düsseldorf dokumentiert, ist die qualitative Anforderung für Transplantate hinsichtlich der Gesamtzellzahl (Im Durchschnitt 1.9-2x109Kernhaltige Zellen) sehr hoch geworden. Dies entspricht ca. 8% der gelagerten Transplantate. Als Konsequenz bedeutet es für die Düsseldorfer Stammzellbank in den letzten Jahren, dass nur die zellreichsten Präparate (10%) eingelagert werden konnten.

Warum sind nur zellreiche Nabelschnurblutprodukte für die Transplantation geeignet?

Die Anzahl der Kernhaltigen Zellen (TNC, hauptsächlich weisse Blutzellen) steht in direkter Korrelation (zumindest bei Entnahme nach der 36 SSW) zu den sogenannten CD34+ Blutstammzellen, die ca. 0.1-1% der TNC darstellen. Sie spielen bei der Rekonstitution des Knochenmarks nach Konditionierung (Chemotherapie) und Bestrahlung eine ganz wesentliche Rolle. Je schneller die „Stammzellen“ im Patienten anwachsen (Engraftment, auch hämatopoietische Rekonstitution), desto früher wird der anti-leukämische Effekt des neuen Knochenmarks etabliert. Zusätzlich ist das Anwachsen der Zellen essentiell, um den Patienten gegenüber Bakterien und Viren zu schützen.

Der Zeitpunkt bis zur Rekonstitution der Granulozyten (>500/µl) und Thrombozyten (>20.000/µl) erfolgt in der Regel nach 21 Tagen. Die Kinetik der Rekonstitution ist abhängig von der applizierten Zellzahl (TNC) und den CD34+ Blutstammzellen. Um die für eine Transplantation notwendige Zelldosis zu bekommen, sollte das Volumen der Spende möglichst groß sein (>60 ml, besser 100-180ml). Dieses Volumen ist allerdings biologisch sehr variabel

Erst als Stammzellbanken weltweit die Qualität ihrer Produkte (Zellzahl) erhöhten, konnten auch erwachsene Patienten (> 70 kg Körpergewicht) erfolgreich transplantiert werden. Arbeiten von J. Wagner, C. Brunstein und MR Verneris zeigten 2004/2005, dass auch zwei Nabelschnurbluttransplantate für einen Patienten transplantiert werden konnten.

Inzwischen sind weltweit mehr als 60% der mit Nabelschnurblut transplantierten Patienten Erwachsene.

Ein weiterer Erfolg in diese Richtung war, dass gezeigt werden konnte, dass Patienten nicht nur myeloablativ, sondern auch non-myeloablativ erfolgreich transplantiert werden konnten, eine Option für Patienten mit Komorbidität und einem Alter > 65 Jahre. Inzwischen zeigen die klinischen Daten diese Doppeltransplantationen den entscheidenden Vorteil, dass trotz HLA- Inkompatibilität die GvHD gering ist, dafür aber ein hoher Graft versus Leukämie Effekt erzielt werden konnte; d.h. viel weniger Rezidive vorhanden waren.

„Nicht-hämatopoietische (-blutbildende)“ Stammzellen im Nabelschnurblut wiederspiegeln Stufen der fetalen Entwicklung und können für die Knorpel-und Knochenregeneration eingesetzt werden

Nicht -hämatopoietische Stammzellen wie stromale Zellen im Nabelschnurblut haben eine sehr geringe Frequenz unter normalen normoxischen Kulturbedingungen. Unter hypoxischen Kulturbedingungen kann diese Frequenz auf ca. 80% gesteigert werden.

Die Heterogenität der fetalen und neonatalen Progenitoren, die man nachweisen kann, lässt sich am ehesten mit der Wanderung und Zirkulation der Stammzellen von der fetalen Leber in das Knochenmark während der Fetalentwicklung erklären.

Stromale, in Stammzellbanken gelagerte Zellen, stellen eine denkbare Alternative für die Knorpel und Knochenregeneration dar, was durch in-vivo Modelle unterstützt wird. Hier stellen die adhärenten stromalen Zellen aufgrund ihrer biologischen Entwicklungsstadien gute Alternativen da, da die Zellen in vivo tatsächlich chondrogen (Knorpel) und osteogen (Knochen) differenzieren.

 

Neurologische Erkrankungen

Tiermodelle für Schlaganfall, Amyotrophe Lateralsklerose, Parkinson, Rückenmarksverletzungen zeigten in den unterschiedlichen Systemen und Applikationen eine Verlangsamung des Krankheitsverlaufs, Überlebensvorteil und eine Verbesserung des Verhaltensmusters, aber keine Differenzierung zu Neuronen. In diesen Modellen konnte eine Migration zum Schädigungsort sowie eine Unterstützung der autologen Neuronenregeneration festgestellt werden. Hier spielen parakrine Mechanismen eine Rolle. Studien der Duke University untersuchen die Verwendung von Nabelschnurblutzellen bei Kindern mit Zerebralparese und Hirnschädigungen wie Sauerstoffmangel bei der Geburt. Erste Ergebnisse sind vielversprechend, können aber erst durch langjährige kontrollierte Doppelblindstudien in der Wirksamkeit belegt werden. Interessant ist die klinische Optionen, diese Kinder nicht autolog sondern allogen mit kurzzeitiger Immunsuppression zu transplantieren, wie von Min et al. gezeigt. Dies bietet den Vorteil, dass man qualitativ hochwertige und gut charakterisierte Präparate zur Verfügung hat, die sofort verfügbar sind.

Erste klinische Studien zur Behandlung von Schlaganfallpatienten mit nicht-HLA, aber Blutgruppen kompatiblen Nabelschnurblut, werden derzeit in den USA auf der Basis der Erstpublikation von Romanov et al. durchgeführt.

 

Weltweites AmfAR (American Foundation for AIDS Research) -Forschungs-und Transplantationsprojekt zur Charakterisierung und Bereitstellung von Nabelschnurbluttransplantaten für HIV Patienten

Der sogenannte „Berliner“ Patient war der erste HIV-Patient, der durch die Transplantation mit einem veränderten CCR5-Gen, der Mutation CCR5Ʌ32, aufgrund einer Akuten Myeloischen Leukämie, transplantiert und dadurch auch langfristig von HIV geheilt wurde. Der Rezeptor CCR5 ist ein essentieller Korezeptor bei der Infektion von HIV. Er ermöglicht das Andocken von HI-Viren an Makrophagen und T-Lymphozyten. Dieser erste Patient stimulierte die Idee, weltweit schon vorab nach Transplantaten mit dieser Mutation zu suchen. Da in den öffentlichen Stammzellbanken sowohl Testmaterial als auch die Transplantate selbst in hoher genetischer Vielfalt zur Verfügung stehen, entstand in Kooperation und durch Unterstützung von amfAR die Idee, diese Präparate in den USA und auch als Europäische Konsortium, auf diese Mutation zu testen. Ungefähr 1% der Europäer zeigt eine homozygote Expression der Mutation. Die Testung und Einstellung der geeigneten Transplantate soll gegenwärtig in ein weltweites Netzwerk erfolgen.

 

Endotheliale Progenitorzellen des Nabelschnurblutes und aus Plasma gewonnenen Thrombozytengel zur Wundheilung

Endotheliale Vorläuferzellen im Nabelschnurblut sind mögliche Kandidaten für eine Gefäßregeneration. Erstmals 1997 beschrieben, wurden sie später nur aufgrund ihrer Morphologie (Cobblestone, „Pflasterähnlich“) charakterisiert. Yoder et al. konnten zeigen, dass nur die zirkulierenden sogenannten ECFC (endothelial colony forming cells) die nativen Endothelzellprogenitoren im Nabelschnurblut darstellen. Eine mögliche klinische Applikation ist die Behandlung von Patienten mit Wundheilungsstörrungen, deren Ursache in einer fehlenden Gefäßbildung liegt. Eine andere Option ist die Verwendung von ECFC im sogenannten „Tissue Engineering“ in Kombination mit autologen oder allogenen Zellen unterschiedlicher Gewebe.

 

Thrombozytengel zur Behandlung des Diabetischen Fußes

Aus verworfenen, nicht für die blutbildende Stammzellbank geeigneten Nabelschnurblutpräparaten, wird derzeit in einer Europäischen Studie Plättchengel aus Nabelschnurblut hergestellt, welches erfolgreiche Anwendung zur Behandlung von Ulcer (u.a. Diabetischer Fuß, aber auch andere Indikationen) findet.

 

Fazit

Allogene hämatopoietische Stammzellen aus Nabelschnurblut sind heute ein weltweit etabliertes Verfahren zur Therapie hämatopoietischer Erkrankungen.

Nicht hämatopoietische Stammzellen wie Endothelzellen und stromale Zellen können aus frischem Nabelschnurblut für regenerative Therapieansätze effizient isoliert werden.

Aus bereits kryokonserviertem Nabelschnurblut können keine klinisch relevanten Mengen Nicht-hämatopoietischer Stammzellen isoliert und angezüchtet werden. Die Knochen- und insbesondere die Knorpelregeneration sind aussichtsreiche klinische Anwendungsbereiche bei der Verwendung von Nabelschnurblut in der regenerativen Medizin.

Für die Applikation bei neurologischen Erkrankungen (u.a. Schlaganfall) können parakrine Mechanismen der Nabelschnurblutzellen genutzt werden. Induzierte pluripotente Stammzellen lassen sich aus unterschiedlichen hämatopoetischen und „Nicht-hämatopoetischen Zellen“ des Nabelschnurblutes leicht gewinnen, sie sind derzeit ein guter Ansatzpunkt für Forschungszwecke und die Etablierung von allogene iPS Stammzellbanken.

Die Sammlung von bestimmten CCR5Ʌ32 Mutationen im weltweiten amfAR Projekt zur Transplantation von HIV Patienten ist nur durch die Kooperation der öffentlichen nicht-kommerziellen Stammzellbanken überhaupt möglich, da nur in den Stammstellbanken eine hohe genetische Vielfalt vorhanden ist und damit auch selektiv diese Mutation getestet werden kann.

Für uns wichtig und entscheidend:

Die Nabelschnurblutspende und die Kooperation mit den Hebammen und Ärzten der Frauenkliniken.

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