Molekulare Diagnostik: Methoden
In der molekularen Diagnostik werden krankheitsrelevante genetische Veränderungen im Erbgut des Menschen nachgewiesen. Nach Amplifikation der relevanten Genabschnitte mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) kann die Art einer Sequenzveränderung mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung bestimmt werden. Bei dieser Methode wird die Nukleotidfolge eines DNA-Fragments nach Durchführung eines Cycle-Sequencing Protokolls und der Sequenzanalyse mittels eines DNA-Sequenzierautomaten (ABI-Kapillarsequenzer) bestimmt. Die erhaltene DNA-Sequenz wird anschließend mit der publizierten DNA-Sequenz verglichen. Eine heterozygote Sequenzveränderung manifestiert sich in der Überlagerung von 2 Peaksignalen (Abb. 3).
Die NGS-Sequenzierung („Next-generation sequencing“) ist eine Hochdurchsatzmethode. Da bei dieser Methode die Sequenzabfolge einzelner DNA-Moleküle bestimmt wird, kann man durch die Abdeckungsrate eine deutlich höhere Sensitivität als bei der Sanger-Sequenzierung erzielen. Sequenzveränderungen, die in unter 1% der Genkopien vorkommen, können noch sicher nachgewiesen werden. Dies ist besonders dann wichtig, wenn es um den Nachweis von Mosaiken (Zellen mit unterschiedlicher genetischer Information innerhalb eines Gewebes) oder minimalen Resterkrankungen geht.
Der Nachweis großer, exonübergreifender Deletionen bzw. Insertionen kann mit den o. g. Methoden nicht erfolgen. Mit Hilfe der MLPA-Analyse („Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification“) kann die Kopienzahl verschiedener Genabschnitte im menschlichen Genom quantifiziert werden. Bei dieser Methode werden Oligonukleotide sequenz-spezifisch hybridisiert und ligiert. Nach einer PCR-Reaktion werden die Amplifikationsprodukte anschließend durch Kapillarelektrophorese nach Größe getrennt (Abb. 4).
Array-CGH
Die genomische Array-CGH Methode erlaubt genomweit eine Untersuchung auf Verluste oder Zugewinne von DNA. Der Vorteil gegenüber einer zytogenetischen Analyse liegt in einer wesentlich höheren Auflösung, die abhängig von der verwendeten Plattform ist. Am Institut für Humangenetik werden routinemäßig Oligonukleotidarrays verwendet mit Oligonukleotidpositionen, die durchschnittlich im Abstand von 13 Kb über das gesamte Genom verteilt sind (4x 180 K Array der Firma Agilent).
Entsprechend erlaubt dies eine hochauflösende Detektion von chromosomalen Imbalancen.
Anwendung findet die Untersuchung u.a. bei Patienten mit Entwicklungsverzögerung und Verdacht auf syndromale Erkrankungen.
Die Methode der genomischen Array-CGH basiert auf der vergleichenden Hybridisierung zweier unterschiedlich markierter DNA-Proben. Nach Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und Denaturierung werden die zu untersuchende Patienten-DNA und eine Referenz-DNA im gleichen Verhältnis auf einen Objektträger hybridisiert, auf dem die Oligomere gebunden vorliegen.
Ist die Kopienzahl zwischen Patienten- und Referenz-DNA gleich, ergibt sich eine theoretische Hybridisierung von jeweils 50 % der beiden DNA`s an die Oligonukleotidzielsequenz. Eine Deletion (Verlust) der Patienten-DNA verursacht eine vermehrte Bindung der Referenz-DNA und Verschiebung zum Grünbereich, bei einer Duplikation (Zugewinn) von Patienten-DNA erfolgt eine Verschiebung in den Rotbereich.
Die Ergebnisse werden anhand eines Chromosomen-Diagramms dargestellt, wobei sich Verluste oder Zugewinne durch eine Abweichung der Positionen von der Mittelllinie darstellen.
