Next-Generation Sequencing genomischer DNA:
Histologische Untersuchung der eingesandten Tumorprobe anhand eines HE-Präparates mit Bestimmung des Tumorzellgehaltes. DNA-Extraktion aus Paraffin-eingebetteten Gewebe mit Mikrodissektion der Tumorzellen. Fluorometrische Quantifizierung doppelsträngiger DNA und Bestimmung des amplifizierbaren DNA-Anteils durch einen Custom qPCR Assay. Erstellung der Library mittels Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 (ThermoFisher Scientific, siehe unten) und Ion AmpliSeq Library Kit Plus (ThermoFisher Scientific) mit anschließender Sequenzierung auf einem Ion S5 Sequenziergerät (ThermoFisher Scientific).
Die Auswertung erfolgt mithilfe der Softwarepakete Torrent Suite, Ion Reporter und IGV in ihren aktuellen Versionen. Für die Interpretation der Varianten werden folgende öffentliche Datenbanken in ihrer jeweils aktuellen Version herangezogen: ClinVar, cBioportal (inkl. OncoKB, CIVIC und cancerhotspot.org), dbSNP, COSMIC. Nach Herausfiltern von Artefakten und anzunehmenden Keimbahnvarianten werden Varianten mit Allelfrequenzen ≥ 5 % berichtet, die die Aminosäuresequenz verändern und als pathogen bzw. vermutlich pathogen beschrieben sind.
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2; ThermoFisher Scientific
Gen | Transcript | Exon |
ABL1 | NM_005157.5 | 4-7 |
AKT1 | NM_001014431.1 | 3, 6 |
ALK | NM_004304.4 | 23, 25 |
APC | NM_000038.5 | 16 |
ATM | NM_000051.3 | 8, 9, 12, 17, 26, 34-36, 39, 50, 54-56, 59, 61, 63 |
BRAF | NM_004333.4 | 11, 15 |
CDH1 | NM_004360.4 | 3, 8, 9 |
CDKN2A | NM_001195132.1 | 2 |
CSF1R | NM_005211.3 | 7, 22 |
CTNNB1 | NM_001904.3 | 3 |
EGFR | NM_005228.4 | 3, 7, 15, 18-21 |
ERBB2 | NM_004448.3 | 19-21 |
ERBB4 | NM_005235.2 | 3, 4, 6-9, 15, 23 |
EZH2 | NM_004456.4 | 16 |
FBXW7 | NM_033632.3 | 5, 8-11 |
FGFR1 | NM_001174067.1 | 5, 8 |
FGFR2 | NM_000141.4 | 7, 9, 12 |
FGFR3 | NM_000142.4 | 7, 9, 14, 16, 18 |
FLT3 | NM_004119.2 | 11, 14, 16, 20 |
GNA11 | NM_002067.4 | 5 |
GNAQ | NM_002072.4 | 5 |
GNAS | NM_000516.5 | 8, 9 |
HNF1A | NM_000545.6 | 3, 4 |
HRAS | NM_001130442.2 | 2, 3 |
IDH1 | NM_005896.3 | 4 |
IDH2 | NM_002168.3 | 4 |
JAK2 | NM_004972.3 | 14 |
JAK3 | NM_000215.3 | 4, 13, 16 |
KDR | NM_002253.2 | 6, 7, 11, 19, 21, 26, 27, 30 |
KIT | NM_000222.2 | 2, 9-11, 13-15, 17, 18 |
KRAS | NM_033360.3 | 2-4 |
MET | NM_001127500.2 | 2, 11, 14 ,16, 19 |
MLH1 | NM_000249.3 | 12 |
MPL | NM_005373.2 | 10 |
NOTCH1 | NM_017617.4 | 26, 27, 34 |
NPM1 | NM_002520.6 | 11 |
NRAS | NM_002524.4 | 2 - 4 |
PDGFRA | NM_006206.5 | 12, 14, 15, 18 |
PIK3CA | NM_006218.3 | 2, 5, 7, 8, 10, 14, 19, 21 |
PTEN | NM_000314.6 | 1, 3, 5-8 |
PTPN11 | NM_002834.4 | 3, 13 |
RB1 | NM_000321.2 | 4, 6, 10, 11, 14, 17, 18, 20 - 22 |
RET | NM_020975.4 | 10, 11, 13, 15, 16 |
SMAD4 | NM_005359.5 | 3 - 6, 8-12 |
SMARCB1 | NM_003073.4 | 2, 4, 5, 9 |
SMO | NM_005631.4 | 3, 5, 6, 9, 11 |
SRC | NM_198291.2 | 14 |
STK11 | NM_000455.4 | 1, 4, 6, 8 |
TP53 | NM_000546.5 | 2, 4-8, 10 |
VHL | NM_000551.3 | 1-3 |