Mykobakterien

Material

Zur Vermeidung einer zeitlichen Verzögerungen der Diagnostik sollte Material für die Tuberkulose-Diagnostik separat eingesendet werden. Materialien, die sowohl auf Mykobakterien als auch auf andere pathogene Erreger untersucht werden, sollten wenn möglich geteilt werden und getrennt, d.h. zwei Proben und zwei Begleitscheine, versendet werden. Ist dies nicht möglich ist auf dem Begleitschein die Zusatzuntersuchung "Tuberkulosediagnostik" anzufordern.
Da Mykobakterien meist nur in geringer Menge im klinischen Untersuchungsmaterial vorhanden sind, muss zum Nachweis von Mykobakterien das Probenvolumen besonders groß sein bzw. müssen manche Materialien wiederholt untersucht werden.

Sputum (2-10 ml):
Entnahme von Morgensputum beim nüchternen Patienten nach Spülung der Mundhöhle mit Wasser. Keinen Speichel (viele Plattenepithelien, wenig Leukozyten) sondern ausschließlich aus den tiefen Atemwegen abgehustetes Sekret gewinnen. Die Expektoration kann durch die Inhalation 15% NaCl-Lösung gefördert werden. Gesamtmenge des morgendlichen Auswurfs in einem fest verschlossenen sterilen Gefäß je 1 mal an drei aufeinanderfolgenden Tagen einsenden.

Tracheal-/Bronchialsekret (2-5 ml):
Trachealsekret durch den Tubus absaugen und in einem sterilen Röhrchen auffangen. Gesamtmenge in einem fest verschlossenen sterilen Gefäß je 1 mal an drei aufeinanderfolgenden Tagen einsenden. Bronchialsekret im Rahmen einer Bronchoskopie absaugen, in ein steriles Röhrchen transferieren und in einem fest verschlossenen sterilen Gefäß einsenden.

Bronchoalveoläre Lavage (10-30 ml):
Im Rahmen einer Bronchoskopie mit 0,9% NaCl-Lsg. spülen und Spülflüssigkeit in ein steriles Röhrchen absaugen und in einem fest verschlossenen sterilen Gefäß einsenden.

Magennüchternsekret (20-30 ml):
Morgens beim nüchternen Patienten gewonnen Magensaft in einem Magensaftröhrchen einsenden. Die Magensaftröhrchen enthalten einen neutralisierenden Puffer, der ein Absterben der Mykobakterien im sauren Magensaft verhindern soll. Magensaftröhrchen können über die Leitstelle der Mikrobiologie angefordert werden. Magennüchternsekret in fest verschlossenen Röhrchen je1 mal an drei aufeinanderfolgenden Tagen einsenden.

Urin (mind. 30-50 ml):
Gesamtmenge des konzentrierten („hochgestellten“) Morgenurins an drei aufeinanderfolgenden Tagen in sterilem Gefäß auffangen und einsenden. Gesamtmenge einsenden!

Menstrualblut:
Möglichst die Gesamtmenge Menstrualblut, Kürettagematerial oder Biopsien ohne Medium in einem fest verschlossenen sterilen Probengefäß einsenden. Menstrualblut kann durch „Auswaschen“ mehrerer blutgetränkter Tupfer oder Tampons in steriler 0,9 % NaCl-Lsg. gewonnen werden. Das Eluat in sterilen Probengefäß je1 mal an drei aufeinanderfolgenden Tagen einsenden.

Ejakulat:
Gesamtes Ejakulat in einem fest verschlossenen sterilen Probengefäß je1 mal an drei aufeinanderfolgenden Tagen einsenden.

Abstriche:
Abstriche in Transportmedium sind zur Tuberkulosediagnostik nicht geeignet.

Knochenmark (5 ml):
Knochenmark in Citrat- oder Heparin-Röhrchen oder in einer für die Mykobakteriendiagnostik geeigneten Blutkulturflasche (Bactec MYCO/FLYTIC) einsenden.

Peripheres Blut (5-10 ml):
In der Regel lassen sich nur bei AIDS-Patienten oder Immunsupprimierten Mykobakterien im Blut nachweisen. Blut in Citrat- oder Heparin-Röhrchen oder in einer für die Mykobakteriendiagnostik geeigneten Blutkulturflasche (Bactec MYCO/FLYTIC) einsenden. Herkömmliche Blutkulturflaschen sind für die Mykobakteriendiagnostik nicht geeignet!
 
Liquor, Eiter, Abszeßpunktate (5-10 ml):
Materialien in sterilen fest verschlossenen Gefäßen ohne Transportmedium oder sonstige Zusätze einsenden.

Gewebeproben:
Repräsentative Menge natives, d.h. nicht fixiertes Gewebe ggf. mit etwas 0,9% NaCl-Lsg. in sterilen fest verschlossenen Probengefäßen ohne Transportmedium einsenden.

Pleurapunktat (mind. 10-30 ml), Aszitis (mind. 20-30 ml), Ergüsse und sonstige Sekrete (mind. 30 ml):
In sterilen fest verschlossenen Probengefäßen ohne Transportmedium einsenden.

Stuhl (2-5g):
Eine Stuhluntersuchung auf Mykobakterien (insbes. bei V.a. MAI) ist in erster Linie bei HIV-Patienten sinnvoll.

Lagerung/Transport

Zügiger Transport ins Labor. Lagerung bei 4-8°C.

Erregerspektrum

Die Tuberkulose (Tbc) des Menschen wird am häufigsten durch Mycobacterium tuberculosis verursacht. Selten werden Mycobacterium bovis (Reservoir in Rindern) und Mycobacterium africanum als Erreger isoliert. Bei Immunsuppri­mierten kann der Tuberkulose-Impfstamm Mycobacterium bovis BCG eine Impf-Tuberkulose hervorrufen. Sehr selten wird Mycobacterium microti (Reservoir in Nagern) als Erreger einer Tuberkulose bei immmunsupprimierten Patienten isoliert. Aufgrund ihrer engen genotypischen und phänotypischen Verwandtschaft werden Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum und Mycobacterium microti zum Mycobacterium tuberculosis-Komplex zusammengefasst.

Im Rahmen der Untersuchung auf Mykobakterien werden häufig nichttuberkulöse (atypische) Mykobakterien isoliert. Besondere klinische Relevanz hat der Nachweis der ubiquitär vorkommenden atypische Mycobakterien bei immun­suppri­mierten Patienten, bei denen diese Erregergruppe eine Vielzahl klinischer Erkrankungsbilder hervorrufen kann.

• Lymphadenitis: M. avium-intrazellulare, M. malmoense, M. interjectum, M. scrofulaceum

• Pulmonale Infektionen: M. avium-intrazellulare, M. malmoense, M. kansasii, M. xenopi, M. chelonae, M. abszessus

• Haut- und Weichteilinfektionen: M. ulcerans, M. marinum

Untersuchungsgang

Erreger und Resistenz:
Die Basisdiagnostik auf Tuberkulose besteht in der Untersuchung eines nach Anreicherung hergestellten und gefärbten Direktpräparates und der Anlage einer Kultur. Zusätzlich kenn eine Untersuchung mittels PCR angefordert werden. Die Menge nachgewiesener säurefester Stäbchen wird semiquantitativ angegeben.
Das Ergebnis der mikroskopischen Untersuchung bzw. einer PCR-Untersuchung liegt innerhalb von 24 Studen. vor und wird als schriftlicher Zwischen­befund ausgegeben. Es ist zu beachten, dass mikroskopisch nicht zwischen Mycobacterium tuberkulosis-Komplex und nicht-tuberkulösen Mykobakterien unterschieden werden kann! Jeder mikroskopische Erstnachweis von säurefesten Stäbchen wird telefonisch gemeldet.

Die sensitivste diagnostische Methode ist die Kultur auf Spezialnährböden. Während der mikroskopische Direktnachweis nur bei Vorhandensein von mind. 105 (bzw. bei angereicherten Proben mind. 103-104) Mykobakterien pro ml Sputum bzw. pro mg Biopsiematerial gelingt, kann ein positives Kulturergebnis bereits ab 10-100 Mykobakterien in gleicher Materialmenge erwartet werden.

In Flüssigkulturen (Bactec MGIT) kann ein Wachstum von Mykobakterien bereits nach 1 Woche nachgewiesen. Ein positives Wachstum im Flüssigkultursystem allein erlaubt noch keine Artdiagnose der Mykobakterien, sie stellt jedoch die Basis für eine genaue Speziesdifferenzierung mittels weiterführender diagnostischer Methoden dar. Die parallele Bebrütung fester Nährböden (Löwenstein-Jensen- und Stonebrink-Medium) dauert meist länger, erlaubt aber eine Beurteilung der Koloniemorphologie. Das Endergebnis der Kultur liegt nach max. 8-10 Wochen vor.

Weiterführende Untersuchungen:

Mycobacterium tuberculosis-Komplex-PCR (Tbc-PCR):
Die PCR ist aufgrund ihrer Empfindlichkeit und möglicher falsch positiver Ergebnisse bei positivem Direktpräparat oder sehr dringendem Verdacht auf eine pulmonale Tuberkulose sinnvoll. Auch nach der Behandlung einer Tbc bleibt die Tbc-PCR bis zu ein Jahr positiv und ist daher nicht zur Therapiekontrolle geeignet!
Da die Tbc-PCR nur für respiratorische Sekrete validiert ist, kann sie zur Diagnostik einer extrapulmonalen Tuberkulose nicht empfohlen werden. Sie wird jedoch bei sehr dringendem klinischen Verdacht z.B. auf eine ZNS-Tuberkulose auch aus anderen Untersuchungsmaterialien (z.B. Liquor) durchgeführt. Ein negatives Ergebnis in der PCR schließt eine Tuberkulose keinesfalls aus.

Kulturell nachgewiesene Mykobakterien werden mittels PCR und Sondenhybridisierung (HAIN-Methode) differenziert. Mikroskopisch positive Materialien und Kulturen können mittels Sondenhybridisierung (HAIN-Methode) auf das Vorhandensein von Resistenzmutationen überprüft werden, um eine eventuelle Resistenz frühzeitiger erkennen zu können.

ELISPOT-TB:
Interferon Gamma Release-Assay für mononukleäre Zellen. Hierbei werden isolierte Lymphozyten und Makrophagen über Nacht mit M. tuberculosis spezifischen Antigenen (ESAT-6 und CFP-10) inkubiert. Diese Antigene sind bei dem zur Impfung verwendeten M.bovis BGC-Stamm nicht vorhanden, daher kommt es bei diesem Test nicht zu einer Kreuzreaktion bei geimpften Patienten. Im Falle einer bestehenden zelluläre Sensibilisierung, reagieren die antigenspezifischen T-Zell-Rezeptoren der T-Gedächniszellen mit den präsentierten MHC-Peptid-Komplexen, wodurch die Sekretion von Interferon Gamma stimuliert wird. Dieses wird am Ort der Sekretion durch membrangebundene Antikörper fixiert, und in einem weiteren Schritt mittels einer Farbreaktion nachgewiesen. Jeder auf der Membran sichtbare Farbfleck repräsentiert also eine antigenspezifische T-Zelle.
Mit dem ELISPOT kann also ein Kontakt des Immunsystems mit M. tuberculosis nachgewiesen werden. Nicht unterscheiden lässt sich, ob es sich um eine akute, latente oder erfolgreich behandelte Erkrankung handelt.